Gram boyama, doku örneklerinde bakteri varlığını araştırmak ve hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine dayalı olarak bakterileri Gram pozitif veya Gram negatif olarak karakterize etmek için kullanılan hızlı bir prosedürdür. Gram boyama, bir bakteri enfeksiyonunun teşhisinde hemen hemen her zaman ilk adım olarak yapılmalıdır.
Gram boyama, adını, tekniği 1882'de geliştiren ve 1884'te benzer klinik semptomlara sahip iki tür bakteriyi ayırt etmek için yayınlayan Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dan (1853 – 1938) almıştır: Streptococcus pneumoniae (olarak da bilinir). pnömokok) ve Klebsiella pneumoniae bakterileri.
adımlar
Bölüm 1/3: Gram Boyası Hazırlama
Adım 1. Laboratuvar çalışması için hazırlanın
Test edeceğiniz bakteri örneğinin kirlenmesini önlemek için eldiven giyin ve uzun saçları toplayın. Davlumbazın altındaki veya iyi havalandırılan başka bir alanda bir çalışma alanını dezenfekte edin. Başlamadan önce bunsen beki ve mikroskobunun çalışır durumda olduğunu kontrol edin.
Adım 2. Bir cam mikroskop lamı sterilize edin
Cam sürgü kirliyse, yağı ve kiri temizlemek için sabunlu suda yıkayın. Lamı etanol, cam temizleyici veya laboratuvarınız tarafından önerilen herhangi bir yöntemle dezenfekte edin.
Adım 3. Örneği slayda ekleyin
Tıbbi numunelerde bulunan bakterileri veya bir petri kabında yetiştirilen bakteri kültürlerini tanımlamaya yardımcı olması için Gram boyama yöntemini kullanabilirsiniz. Gram boyamanın faydalı olması için bir ince leke üzerindeki numune tabakası. Daha yaşlı bakteriler, gram boyamaya daha az tahmin edilebilir şekilde yanıt veren hücre duvarlarına zarar verebileceğinden, 24 saatin altındaki bir numune önerilir.
- Bir doku örneği kullanıyorsanız, cam slayt üzerine 1-2 damla ekleyin. İkinci bir sterilize edilmiş cam lamın kenarını kullanarak ince bir leke oluşturacak şekilde lam üzerine eşit şekilde yayın. Devam etmeden önce havayla kurumasına izin verin.
- Bir petri kabından bakteri alıyorsanız, bir Bunsen beki alevinde bir aşılama döngüsünü parlayana kadar sterilize edin, ardından soğumaya bırakın. Slayt üzerine bir damla steril su yerleştirmek için kullanın, ardından küçük bir bakteri örneğini aktarmadan ve suya hafifçe karıştırmadan önce halkayı sterilize edin ve soğutun.
- Et suyu içindeki bakteriler bir vorteksleyicide karıştırılmalı, daha sonra fazladan su ilave edilmeden yukarıdaki gibi bir aşılama döngüsü ile eklenmelidir.
- Bir sürüntü örneğiniz varsa, sürüntüyü slayt boyunca hafifçe döndürün.
Adım 4. Yaymayı ısıyla sabitleyin
Isı, bakterileri slayta sabitler, böylece leke sırasında kolayca durulanmazlar. Sürgüyü bir Bunsen brülör alevinden iki ila üç kez hızlıca geçirin veya elektrikli bir slayt ısıtıcısının üzerinde ısıtın. Aşırı ısıtmayın, aksi takdirde numuneler bozulabilir. Bunsen beki kullanılıyorsa, alev uzun turuncu değil, küçük, mavi bir koni olmalıdır.
Alternatif olarak, leke, kurutulmuş yayma üzerine 1-2 damla metanol eklenerek, fazla metanol boşaltılarak ve havada kurumaya bırakılarak metanol ile sabitlenebilir. Bu yöntem, daha temiz bir arka plan vererek, konak hücrelere verilen zararı en aza indirir
Adım 5. Slaytı bir boyama tepsisine yerleştirin
Bir boyama tepsisi, üstünden geçen küçük bir ağ veya tel desteği olan sığ bir metal, cam veya plastik tabaktır. Sürgüyü bu desteğin üzerine yerleştirin, böylece kullanacağınız sıvılar tepsiye akabilir.
Boyama tepsiniz yoksa, slayt doğrudan plastik bir buz küpü tepsisinin üzerine yerleştirilebilir
Bölüm 2/3: Gram Boyasının Yapılması
Adım 1. Smear'ı kristal menekşe ile yıkayın
Bakteri örneğini bazen centiyana menekşesi olarak adlandırılan birkaç damla kristal viyole boya ile doldurmak için bir pipet kullanın. Otuz ila altmış saniye bekleyin. Kristal menekşe (CV), sulu çözeltilerde CV+ ve klorür (Cl–) iyonlarına ayrışır. Bu iyonlar, hem gram-pozitif hem de gram-negatif hücrelerin hücre duvarı ve hücre zarından geçer. CV+ iyonu, hücreleri mora boyamak için bakteri hücrelerinin negatif yüklü bileşenleri ile etkileşime girer.
Birçok laboratuvar, çökelmeyi önlemek için amonyum oksalat ekleyen "Hucker's" kristal menekşesini kullanır
Adım 2. Kristal menekşeyi nazikçe durulayın
Slaytı eğin ve lamın üstüne küçük bir damıtılmış veya musluk suyu akışı fışkırtmak için bir yıkama şişesi kullanın. Su, lekenin yüzeyinden aşağı akmalı, ancak doğrudan ona doğrultulmamalıdır. Gram pozitif bakterilerden lekeyi çıkarabileceğinden aşırı durulamayın.
Adım 3. Smear'ı iyotla yıkayın, ardından durulayın
Yaymayı iyotla kaplamak için bir pipet kullanın. En az 60 saniye bekletin, ardından aynı dikkatli yöntemle durulayın. İyot, negatif yüklü iyonlar biçiminde, hücrenin iç ve dış katmanlarında büyük kristal mor ve iyot kompleksleri (CV-I kompleksleri) oluşturmak için CV+ ile etkileşir. Bu, mor kristal menekşe rengini, lekeli olduğu her yerde hücrede yakalayacaktır.
İyot aşındırıcıdır. Soluma, yutma veya cilt temasından kaçının
Adım 4. Bir renk giderici ekleyin, ardından hızla durulayın
Dikkatle zamanlanması gereken bu kritik adım için tipik olarak 1:1 aseton ve etanol karışımı kullanılır. Sürgüyü belirli bir açıyla tutun, ardından boşaltma akışında artık mor renk görünmeyene kadar renk gidericiyi ekleyin. Bu, tipik olarak 10 saniyenin altında veya renk giderici daha yüksek konsantrasyonlarda aseton içeriyorsa daha az zaman alır. Derhal durun, aksi takdirde renk giderici hem gram pozitif hem de negatif hücrelerden kristal viyole lekesini çıkaracak ve lekenin tekrarlanması gerekecektir. Daha önceki tekniği kullanarak, fazla renk gidericiyi hemen durulayın.
- Bunun yerine saf (%95+) aseton kullanılabilir. Ne kadar fazla aseton varsa, renk giderici o kadar hızlı çalışır ve daha hassas zamanlama gerektirir.
- Bu adımı zamanlama konusunda sorun yaşıyorsanız, renk gidericiyi damla damla eklemeyi düşünün.
Adım 5. Smear'ı karşıt boya ile yıkayın, ardından durulayın
Bir karşı boya, tipik olarak safranin veya fuksin, rengi giderilmiş (gram-negatif) bakterileri pembe veya kırmızıya boyayarak gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler arasında ekstra kontrast eklemek için kullanılır. En az 45 saniye açık bırakın, ardından durulayın.
Fuchsin, hemophilus spp ve legionella spp gibi birçok gram negatif bakteriyi daha yoğun şekilde boyayacaktır. Bu, yeni başlayanlar için daha iyi bir seçenek haline getirebilir
Adım 6. Slaytı kurutun
Slaytı havada kurumaya bırakabilir veya bu amaç için satılan bibulous kağıt kullanarak kurumasını sağlayabilirsiniz. Gram boyama tamamlandı.
Bölüm 3/3: Sonucu İnceleme
Adım 1. Işık mikroskobunu hazırlayın
Slaytı ışık mikroskobunun altına yerleştirin. Bakterilerin boyutu büyük ölçüde değişir, bu nedenle gereken toplam büyütme 400x ile 1000x arasında değişecektir. Bu büyütmelerin daha yüksek ucunda, daha fazla netlik için yağa daldırmalı bir objektif lensi önerilir. Kabarcıkları önlemek için uygulama sırasında hareketten kaçınarak slayt üzerine bir damla daldırma yağı koyun. Mikroskop taretini, objektif lensi yağa dokunarak yerine oturacak şekilde hareket ettirin.
Yağa daldırma, "kuru" bir mercek değil, yalnızca özel olarak tasarlanmış merceklerde kullanılabilir
Adım 2. Gram pozitif ve gram negatif bakterileri tanımlayın
Slaytı ışık mikroskobu altında inceleyin. Gram pozitif bakteriler, kalın hücre duvarları içinde hapsolmuş kristal menekşe nedeniyle mor görünür. Menekşe ince hücre duvarlarından yıkandığı için gram negatif bakteriler pembe veya kırmızı görünür, ardından pembe karşıt leke onlara girer.
- Numune çok kalınsa yanlış pozitif sonuçlar görebilirsiniz. Sonucun doğru olduğundan emin olmak için tüm bakteri türleri gram pozitifse yeni bir örneği boyayın.
- Renk giderici çok uzun süre çalıştıysa, yanlış negatif sonuçlar görebilirsiniz. Sonuçlarınızı tekrar kontrol etmek için tüm bakteri türleri gram negatifse yeni bir numune boyayın.
Adım 3. Referans resimlerine bakın
Bir bakterinin ne olduğundan emin değilseniz, gram boyamanın şekline ve sonucuna göre sıralanmış bir referans resim koleksiyonuna bakın. Veritabanlarını çevrimiçi olarak Ulusal Mikrobiyal Patojen Veritabanında ve diğer birçok sitede bulabilirsiniz. Tanımlamayı kolaylaştırmak için yaygın veya tanı açısından önemli örnekler aşağıda gram durumuna ve şekline göre sıralanmıştır.
Adım 4. Gram pozitif bakterileri şekle göre tanımlayın
Bakteriler ayrıca mikroskop altında şekillerine göre, en yaygın olarak kok (küresel) veya çubuklar (silindirik) olarak sınıflandırılır. İşte şekle göre organize edilmiş birkaç yaygın gram pozitif (mor lekeli) bakteri:
- Gram pozitif koklar genellikle ya Stafilokoklar (kümelerdeki koklar anlamına gelir) ya da Streptokoklar (zincirlerdeki koklar anlamına gelir).
- Gram pozitif çubuklar Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ve Listeria'yı içerir. Actinomyces spp. çubukların genellikle dalları veya filamentleri vardır.
Adım 5. Gram negatif bakterileri tanımlayın
Gram negatif (pembe lekeli) bakteriler genellikle üç gruba ayrılır. Koklar küresel bakterilerdir, çubuklar uzun, ince bakterilerdir ve kokoid çubuklar arada bir yerdedir.
- Gram negatif koklar en yaygın olarak Neisseria spp.
- Gram negatif çubuklar E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas ve diğerlerini içerir. Vibrio cholerae sıradan çubuklar veya kavisli çubuklar olarak görünebilir.
- Gram negatif "kokoid" çubuklar (veya "kokobasiller") Bordetella, Brucella, Haemophilus ve Pasteurella'yı içerir.
Adım 6. Karışık sonuçları değerlendirin
Bazı bakterilerin hücre duvarlarının kırılganlığı veya mumlu olması nedeniyle tam olarak lekelenmesi zordur. Aynı hücrede veya aynı yaymadaki farklı hücreler arasında mor veya pembe leke karışımına sahip olabilirler. 24 saatten eski herhangi bir bakteri örneğinde bu sorun olabilir, ancak bazı türlerin her yaşta lekelenmesi zordur. Aside dirençli leke, kültür büyümesi gözlemi, TSI ortam kültürleri veya genetik testler gibi tanımlamayı daraltmak için daha özel testler gerektirebilirler.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ve Propionibacterium spp. hepsi gram-pozitif bakteriler olarak kabul edilir, ancak çoğu zaman sonuçsuz bir şekilde boyanmış görünürler.
- Treponema, Chlamydia ve Rickettsia spp. gibi küçük ve ince bakteriler. uygun şekilde Gram boyama yapmak zordur.
Adım 7. Malzemeleri atın
Atık bertaraf prosedürleri laboratuvarlar arasında ve kullanılan malzemelere göre değişiklik göstermektedir. Tipik olarak, boyama tepsisindeki sıvı, tehlikeli atık olarak kapalı şişelerde bertaraf edilir. Slaytları %10 çamaşır suyu çözeltisine batırın, ardından keskin kaplara atın.
İpuçları
- Gram boyamadaki verimin yalnızca numune kadar iyi olduğunu unutmayın. Hastalara iyi numuneler sağlamayı öğretmek önemlidir (örneğin, balgam numuneleri için tükürme ile derin öksürük arasındaki fark).
- Renk giderici olarak etanol asetondan daha yavaş etki eder.
- Standart laboratuvar önlemlerine uyun.
- Numunenin hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakteri içermesi gerektiğinden, uygulama için bir yanak çubuğu kullanın. Yalnızca bir tür görüyorsanız, muhtemelen çok az veya çok fazla renk giderici kullanıyorsunuzdur.
- Sürgüyü kavramak için yaylı tip ahşap mandal kullanabilirsiniz.
Uyarılar
- Aseton ve etanol yanıcıdır. Aseton, ellerinizdeki yağları temizleyerek cildinizin diğer kimyasalları daha kolay emmesine neden olur. Eldiven giyin ve dikkatli kullanın.
- Lekeyi veya karşı lekeyi durulamadan önce lekenin kurumasına izin vermeyin.